Indukowana przez gentamycynę korekcja funkcji CFTR u pacjentów z mukowiscydozą i mutacjami stopu CFTR czesc 4

W celu zbadania przenikalności chlorku nosa i aktywacji przez cAMP przenikalności chlorków, uzyskano duży gradient chemiczny chlorków w błonie wierzchołkowej przez przepłukanie błony śluzowej nosa roztworem wolnym od chlorków zawierającym 10-4 moli amilorydu na litr w ilości 5 ml na minutę przez trzy minuty. Następnie śluzówkę perfundowano przez trzy minuty tym samym roztworem, do którego dodano izoproterenol (10-5 mol na litr). Zmiana napięcia w ciągu ostatnich sześciu minut służyła jako wskaźnik transportu chlorku nabłonka. Mikroskopia immunofluorescencji pierwotnych ludzkich komórek dróg oddechowych
Pierwotne komórki nabłonkowe nosa od dwóch pacjentów z mukowiscydozą, które były heterozygotami złożonymi w przypadku mutacji W1282X i .F508, i którzy uczestniczyli w badaniu gentamycyny, uzyskano poprzez skrobanie przed i po leczeniu gentamycyną, a następnie rozprowadzono je na szkiełkach mikroskopowych. Komórki nabłonka nosa również uzyskano od trzech zdrowych osobników kontrolnych jako pozytywne kontrole. Komórki utrwalano lodowatym metanolem przez 10 minut, suszono na powietrzu i przechowywano w suchych warunkach. Przed analizą immunocytochemiczną próbki ponownie uwodniono w roztworze soli buforowanym fosforanem (pH 7,4) przez 10 minut, a następnie traktowano surowicą kozią (rozcieńczenie 1:20) przez 30 minut w celu zablokowania nieswoistych miejsc wiążących białka. CFTR wykrywano za pomocą monoklonalnego przeciwciała 24-1 (5 .g na mililitr, American Type Culture Collection HB-11947, R & D Systems), który rozpoznaje aminokwasy 1477 do 1480 na C-końcu białka CFTR. Nieimmunizacyjne mysie IgG zastosowano jako kontrolę ujemną. Antimouse IgG (Alexa Fluor 594, Molecular Probes) zastosowano jako drugorzędowe przeciwciało (rozcieńczenie 1: 500). Preparaty zostały zamontowane na podłożu Vectashield zawierającym 4,6, diamidino-2-fenyloindol, który barwi jądro (Vector Laboratories). Przynajmniej 150 komórek z każdej próbki badano na mikroskopie epifluorescencyjnym Leitza wyposażonym w silnik krokowy, zespół filtra-koła (Ludl Electronics Products) i zestaw filtra 83000 (Chroma Technology). Obrazy uzyskano za pomocą kamery HD z aparatem wysokiej rozdzielczości SenSys-Cooled (Photometrics). Częściową dekonwolucję obrazów przeprowadzono przy użyciu oprogramowania IPLab (Scanalytics). Obrazy otrzymano w sposób losowy. Przeanalizowano co najmniej 15 obszarów każdej próbki. Liczba komórek obecnych w każdym obszarze wynosiła od około 7 do 45 komórek. Intensywność barwienia różniła się w każdej próbce. Dlatego wszystkie obrazy zostały znormalizowane na większą intensywność fluorescencji tła bez zmiany maksymalnej intensywności fluorescencji. Wstępne doświadczenia w celu przetestowania swoistości i czułości testu przeprowadzono przy użyciu preparatów komórkowych otrzymanych od osób kontrolnych i pacjentów homozygotycznych pod względem mutacji .F508.
Analiza statystyczna
Dane o potencjalnej różnicy analizowano za pomocą procedury dla wzoru krzyżowego.23 Każda zmienna była oceniana pod kątem efektu przeniesienia, efektu okresu i efektu leczenia przy użyciu zarówno parametrycznego dwustronnego t-testu, jak i nieparametrycznego. Test Manna-Whitneya. Gdyby stwierdzono znaczny efekt przeniesienia, pomiary uzyskane w drugim okresie zostałyby zignorowane, a jedynie pomiary uzyskane w pierwszym okresie zostałyby wykorzystane
[patrz też: pediatra na telefon poznań, drenaż limfatyczny cena, toxo igg cena ]
[podobne: trabekuloplastyka laserowa, dyżur aptek tarnobrzeg, dexacaps ]